长读长测序服务

01概述和价值链

标记： [EC: IVDR 2017/746 (EU) + FDA LDT/IVD oversight + ISO 15189 | OECD: Genomics & bioinformatics | Regulator: FDA (USA), NMPA (China)]

长读长（第三代）测序可连续读取10,000到超过1,000,000个碱基的DNA片段， 而Illumina短读长NGS仅读约150-300个碱基。这些长读长能解析高重复区 （着丝粒、端粒、节段重复），填补短读长在参考基因组中留下的空白， 并实现端粒到端粒的de novo组装。两大平台双寡头主导：Oxford Nanopore （ONT），将单链DNA或RNA穿过蛋白质纳米孔并读取离子电流变化，可直接 测序原生DNA和RNA并同时检测5mC/5hmC/m6A甲基化，无需PCR扩增；以及 PacBio SMRT，其零模波导（ZMW）进行环形共识测序，产生约15-20 kb的 HiFi读长，准确度高于99.9%（Q30）。服务涵盖de novo组装、结构变异检测、 单倍型定相、宏基因组和临床遗传学，受FDA和NMPA作为IVD/LDT监管，并在 欧盟IVDR下运行。本投影中的六家机构涵盖两大平台（Oxford Nanopore、 PacBio）与服务生态系统（NextOmics、Genoscope、Broad Institute、 SciLifeLab）。

长读长测序服务的主要方向：

1. 端粒到端粒的de novo组装： 长读长闭合短读长无法解析的重复和缺口。
2. 直接表观遗传检测： 无需亚硫酸盐转化的原生5mC/5hmC/m6A（ONT）或基于聚合酶动力学（PacBio）。
3. 结构变异与临床遗传学： 短读长无法发现的平衡易位和重复扩增疾病。
4. 现场与环境宏基因组： 便携式MinIRON实时海洋与土壤监测（Genoscope）。

行业价值链

[高分子量DNA提取] ──> [文库制备] ──> [测序运行] ──> [碱基识别]
                                            │
                                （表观遗传学+组装）
                                            │
                                            ▼
[验证报告] <─── [生物信息学] <─────┘

价值链层级

该行业的跨领域技术：

• nanopore-sequencing： 经蛋白质纳米孔的直接链DNA/RNA，配合AI碱基识别（Dorado）。
• smrt-sequencing： 零模波导中的环形共识HiFi读长（PacBio Revio）。
• genome-assembly： 用于de novo组装和定相的OLC组装器（Flye、Hifiasm、Minimap2）。

02美国

美国通过PacBio平台垄断和最大的联邦学术测序核心，在高精度长读长测序 方面领先。

PacBio平台、泛基因组参考、FDA监管

• PacBio： Revio、Onso和Vega长读长系统；其2026年发货的新SPRQ-Nx化学将HiFi人类基因组降至每个300美元以下，使大型队列项目成为可能。
• Broad Institute： 开发泛基因组和de novo组装流程，并参与人类泛基因组参考联盟（HPRC），以捕获人群多样性的图取代扁平的GRCh38参考。
• NIH All of Us长读长核心： 集成PacBio Revio产能，用于与罕见疾病相关的结构变异发现。
• FDA LDT/IVD监管： 临床长读长测试在此监管框架下进行验证。

03中国

中国将长读长测序整合进临床遗传学和肿瘤学，并运营该地区最大的专用 长读长服务工厂。

长读长CRO、共条码化、临床结构变异

• NextOmics（武汉）： 运营亚洲最大的长读长工厂之一，运行数十台PacBio Revio和ONT PromethION系统，提供植物、动物和人类de novo基因组服务。
• BGI stLFR： 单管长片段读共条码化，在MGI仪器上以廉价短读长模拟长读长。
• 临床结构变异筛查： 产前和肿瘤中心率先将长读长常规检测平衡易位和重复扩增纳入实践，在NMPA IVD监管下。

04欧盟

欧盟在便携式和环境纳米孔测序方面领先，依托Oxford Nanopore总部和密集 的国家生物信息学研究所网络。

Oxford Nanopore、环境宏基因组、临床基因组学

• Oxford Nanopore（牛津）： 便携式MinIRON测序仪和高通量PromethION 48，以及让小实验室也能用上廉价长读长的PromethION 2 Solo；R10.4.1化学，支持直接DNA/RNA和甲基化读取。
• Genoscope（法国）： 国家测序中心利用纳米孔进行实时海洋和土壤宏基因组监测（如nanoMDBG组装）。
• SciLifeLab（瑞典）： 国家级基础设施，其临床基因组学部门提供长读长诊断，并参与欧洲泛基因组联盟。

05领先公司和研究机构

06技术栈和创新

该技术栈结合了蛋白质工程纳米孔、纳米加工光学芯片和专门的长读长组装 算法。

1. 纳米孔测序（ONT）：
   • 工程化蛋白质通道（R10.4.1，CsgG突变体）嵌入合成膜；马达解旋酶以约每秒400个碱基的速度牵引单链DNA，离子电流轨迹由深度学习碱基识别器（Dorado）解码为碱基，直接读取原生DNA、RNA和甲基化。
2. SMRT环形共识测序（PacBio）：
   • 零模波导（约100 nm孔）各固定一个聚合酶；环形SMRTbell模板被反复读取并共识折叠为Q30（>99.9%）的HiFi读长，新SPRQ-Nx化学将HiFi人类基因组推至300美元以下。
3. 组装生物信息学：
   • 由于长读长击败短读长de Bruijn组装器，改用OLC组装器——纳米孔用Flye、二倍体/多倍体HiFi定相用Hifiasm——配合Minimap2比对，产生端粒到端粒组装。

07价值链和生产管线

PacBio Revio上病原体基因组de novo组装的工业管线（ISO 15189）

┌───────────────────────────┐      ┌───────────────────────────┐
│ 1. 高分子量DNA提取        │ ───> │ 2. SMRTbell文库           │
└───────────────────────────┘      └───────────────────────────┘
                                                 │
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┌───────────────────────────┐      ┌───────────────────────────┐
│ 4. ZMW测序（Revio）       │ <─── │ 3. SMRT池加载             │
└───────────────────────────┘      └───────────────────────────┘
              │
              ▼
┌───────────────────────────┐      ┌───────────────────────────┐
│ 5. CCS碱基识别 + 5mC      │ ───> │ 6. Hifiasm组装            │
└───────────────────────────┘      └───────────────────────────┘

阶段 1：高分子量DNA提取

从病原体培养物中温和（无剪切）地分离高分子量DNA，并检查片段长度、浓度和纯度。

阶段 2：SMRTbell文库制备

将高分子量DNA切片并连接发夹接头，形成闭合环形SMRTbell模板，然后清除未连接物质。

阶段 3：SMRT池加载

聚合酶与带引物的SMRTbell模板结合，复合物加载到Revio SMRT池上，沉降入零模波导孔。

阶段 4：ZMW测序

Revio在24小时运行中实时成像各孔，记录掺入荧光核苷酸时的环形读长。

阶段 5：CCS碱基识别与修饰调用

机载GPU将重复读长折叠为高精度HiFi共识序列，并从脉冲间动力学调用5mC甲基化。

阶段 6：Hifiasm组装

Hifiasm根据HiFi读长进行端粒到端粒的de novo组装，叠加甲基化图谱，并向临床或监测用途归档LIMS报告。