CRISPR 筛选即服务

01概览与价值链

标记: [EC: ATMP Regulation (EC No 1394/2007) | OECD: Bio-Pharmaceuticals | 监管机构: FDA (美国), EMA (欧盟), NMPA (中国)]

CRISPR 筛选即服务是一个大型 B2B/CRO 板块：在哺乳动物细胞中进行高通量功能基因组筛选，以发现药物 靶点和耐药机制。池化向导 RNA（sgRNA）文库靶向敲除（CRISPR-KO）、激活（CRISPRa）或抑制（CRISPRi） 数千个基因；通过慢病毒载体以感染复数 MOI <1 递送；读出采用深度测序（NGS）+ MAGeCK 生物信息学。 全基因组文库含 80,000–120,000 条独特 sgRNA（每基因 4–6 条向导），覆盖度 ≥ 500 细胞/向导。

CRISPR 筛选的关键平台：

1. 池化文库 (Pooled CRISPR Libraries): 一管数千质粒——一次实验覆盖全基因组。
2. CRISPRa/CRISPRi: dCas9-VP64（激活）和 dCas9-KRAB（抑制），不断裂 DNA。
3. 单细胞 / Perturb-seq: CRISPR 筛选 + scRNA-seq——每次扰动一个表达谱。
4. 阵列式筛选 (Arrayed): 每孔一条向导——表型读出。

产业价值链

[sgRNA 文库设计] ──> [寡核苷酸合成+克隆] ──> [慢病毒包装]
                                              │
                                    (转导，MOI<1)
                                              │
                                              ▼
[靶点 (MAGeCK)] <─── [NGS + 生物信息] <─── [细胞筛选]

价值链层级

行业的横切技术：

• 池化文库 (Pooled Libraries): 一次实验覆盖全人类基因组。
• Perturb-seq: CRISPR + scRNA-seq——每次基因扰动一个表达谱。
• 机器人培养箱: Cytomat，覆盖度 ≥ 500 细胞/向导。

02美国

美国在合同 CRISPR 筛选的专利和商业化方面领先。

Synthego, Revvity/Horizon, FDA IND decisions

• Synthego: 高质量 sgRNA 合成与一站式细胞工程。
• Horizon Discovery (Revvity): 历史最悠久的供应商；CRISPRa/CRISPRi 文库。
• FDA: 评估 IND 候选药物作用机制时依赖 CRISPR 筛选数据。

03中国

中国押注价格优势和机器人化细胞培养的规模。

GenScript, Suzhou clusters, national sgRNA libraries

• GenScript: 最大的质粒和慢病毒文库 B2B 生产商；在原代 T 细胞上筛选。
• 苏州生物医药集群: 筛选成本比美国低 2–3 倍。
• 中国科技部: 面向作物和畜牧的国家 sgRNA 文库。

04欧盟

欧盟优先发展 Perturb-seq、结构生物学和靶点去风险。

DKFZ/Max Delbrück, Perturb-seq, EMA de-risking

• DKFZ（德国）: 肿瘤筛选、CRISPR 数据 AI 分析；胶质母细胞瘤耐药性。
• Perturb-seq 联盟（德/法）: 靶向治疗的罕见耐药机制。
• EMA: 强制在细胞面板上做靶点去风险——稳定的 B2B 需求。

05领先企业与研究机构

06技术栈与创新

该技术栈以慢病毒载体、变体 Cas9 和 NGS 分析为基础。

1. 慢病毒载体（第三代）:
   • 自失活（SIN）HIV-1 系统用于稳定 sgRNA 整合。
2. 变体 Cas9 (Modified Cas9):
   • Cas9（CRISPR-KO）、dCas9-KRAB（CRISPRi）、dCas9-VP64-p65-RTA（CRISPRa）。
3. NGS + 生物信息:
   • Illumina NovaSeq X Plus + MAGeCK/BAGEL 用于靶点排序和假阳性控制。

07价值链与生产管线

B2B CRISPR 筛选服务工业管线

┌───────────────────────────┐      ┌───────────────────────────┐
│ 1. crRNA 文库设计          │ ───> │ 2. 合成与克隆              │
└───────────────────────────┘      └───────────────────────────┘
                                                 │
                                                 ▼
┌───────────────────────────┐      ┌───────────────────────────┐
│ 4. 转导 MOI=0.3            │ <─── │ 3. 慢病毒生产              │
└───────────────────────────┘      └───────────────────────────┘
              │
              ▼
┌───────────────────────────┐      ┌───────────────────────────┐
│ 5. 筛选（毒素）            │ ───> │ 6. NGS + MAGeCK 报告       │
└───────────────────────────┘      └───────────────────────────┘

阶段 1: 文库设计

sgRNA 池——每基因 4–6 条向导，共 80,000–120,000 条序列，按客户靶点设计。

阶段 2: 合成与克隆

芯片固相寡核苷酸合成，Gibson Assembly 克隆入慢病毒载体。

阶段 3: 慢病毒生产

HEK293T 生产，超滤浓缩，滴定（TU/ml）。

阶段 4: 转导

细胞感染（如 H1975），MOI = 0.3——每细胞一次整合；嘌呤霉素筛选。

阶段 5: 筛选

实验组（加抑制剂）与对照组；14 天；死亡细胞从池中清除。

阶段 6: NGS 与生物信息

sgRNA 盒 PCR、NGS，MAGeCK 按富集/耗竭对基因排序——耐药靶点报告。