# 无细胞系统与无细胞生物制造 无细胞蛋白合成（CFPS）绕过活细胞：反应管中的核糖体和翻译因子在数小时（而非数周）内产出目标蛋白，并可掺入有毒和非天然氨基酸。 Source: https://cn.bioecon.ru/technology/cell-free-systems-cell-free-bioproduction/ Updated: 2026-08-18 ## 概览与价值链 标记: [EC: Industrial Biotechnology & Synthetic Biology Roadmap | OECD: Industrial Biotechnology | 监管机构: FDA (美国), EMA (欧盟), NMPA (中国)] 无细胞系统（Cell-Free Protein Synthesis，CFPS）是一种在工业合成中摒弃活宿主细胞的范式：仅从生物体 提取翻译分子机器（核糖体、tRNA、起始/延伸/终止因子），在反应管中与 DNA 模板、氨基酸和 ATP 再生 系统组装。活细胞将多达 80% 的资源用于自身代谢；无细胞系统将全部活性导向产物，把合成从数周缩短到 数小时，并能生产对细胞有毒的蛋白以及掺入非天然氨基酸。 无细胞生产的关键平台： 1. **裂解物 CFPS (Cell Lysate CFPS):** E. coli、CHO、麦胚提取物——即用型翻译复合体。 2. **重建 PURE (PURE):** 36 种纯化 E. coli 酶，无内源蛋白酶——绝对纯度。 3. **酶级联 (Cell-Free Cascades):** 10–20 种耐热酶，无需细胞即可将糖转化为化学品。 4. **纸基传感器 (Paper TX-TL):** 冻干 TX-TL + 核糖开关，用于现场诊断。 ### 产业价值链 ``` [生产菌培养] ──> [裂解与离心] ──> [裂解物] │ (DNA + ATP 级联) │ ▼ [目标蛋白] <─── [亲和纯化] <─── [体外合成，数小时] ``` ### 价值链层级 | 层级 | 描述 | 关键输入/输出 | |:---|:---|:---| | **Lysate Production** | 细胞培养、裂解、核糖体/酶分离 | **入:** 细胞、匀浆机。**出:** 标准化裂解物。 | | **Energy Formulation** | ATP 再生缓冲液（磷酸烯醇丙酮酸/葡萄糖） | **入:** 辅因子、氨基酸。**出:** 能量混合物。 | | **DNA Template** | 带有 T7 启动子的 de novo 合成/扩增 | **入:** 数字基因设计。**出:** DNA 模板。 | | **In-Vitro Synthesis** | +30–37°C 混合裂解物、缓冲液、模板 | **入:** 裂解物、缓冲液、模板。**出:** 反应混合物。 | | **Purification** | 亲和层析与过滤 | **入:** 反应混合物。**出:** 纯蛋白。 | | **On-Demand Distribution** | 用于现场合成的冻干试剂盒 | **入:** 冻干物、卡盒。**出:** 现场试剂盒。 | 行业的横切技术： - **廉价底物 ATP 再生:** 葡萄糖/淀粉上的 10–12 酶级联，能量成本降低 100 倍。 - **非天然氨基酸 (nSAA):** 重分配 tRNA/合成酶以掺入人工氨基酸（ADC、点击化学）。 - **连续流微流控反应器:** 连续补料并去除抑制剂——可连续合成数日。 --- ## 美国 美国在治疗性蛋白和 RNA 农药的无细胞商业化方面领先（DARPA、风投）。 ### Sutro, GreenLight, Jewett Lab, DARPA on-demand pharmacy - **Sutro Biopharma:** 基于 E. coli/CHO 裂解物的 XpressCF® 平台——抗体和 ADC，反应器达数千升。 - **GreenLight Biosciences:** 无细胞合成 dsRNA 和 mRNA（农用农药、疫苗），吨级产能。 - **DARPA 现场制药 + Jewett Lab（西北大学）:** 由冻干卡盒驱动的便携合成箱。 --- ## 中国 中国押注大规模无细胞酶级联（中科院、TIB）。 ### TIB CAS, cell-free starch from CO2, cascade biocatalysis - **TIB CAS（ASAP）:** 11 酶级联由 CO2/H2 合成淀粉——效率为玉米光合作用的 8.5 倍。 - **多步生物催化:** 稀有糖（阿洛酮糖、塔格糖）、肌醇、氨基酸，无需活体 GMO。 - **国家重点研发计划:** 用于连续工业反应器的固定化酶。 --- ## 欧盟 欧盟在高纯度 PURE 系统和无细胞产物的安全标准方面领先。 ### PUREfrex (GeneFrontier), Horizon Europe, Max Planck/CNRS - **PUREfrex (GeneFrontier):** 由 36 种酶重建的系统——无细菌 LPS 的蛋白筛选。 - **Horizon Europe:** 用于食品和纺织酶的微流控/膜反应器。 - **Max Planck/CNRS:** 人造细胞——脂质囊泡中的无细胞系统。 --- ## 领先企业与研究机构 | 公司 / 机构 | 国家 | 关键产品 / 平台 | 技术特点 | 2026 年状态 | |:---|:---|:---|:---|:---| | **Sutro Biopharma** | 🇺🇸 美国 | *XpressCF®*（CDMO） | CHO/E. coli CFPS 达数千升；毒性蛋白、ADC | 商业化 | | **GreenLight Biosciences** | 🇺🇸 美国 | 无细胞 RNA 平台 | 酶法 dsRNA/mRNA 吨级合成 | 商业化 | | **GeneFrontier** | 🇯🇵 日本 | *PUREfrex®* | 36 种纯化酶、无蛋白酶 | 商业化 | | **TIB CAS** | 🇨🇳 中国 | *ASAP*（CO2 合成淀粉） | 11 酶级联、8.5× 光合作用 | 研究 | | **Swiftscale Biotherapeutics** | 🇺🇸 美国 | 快速 CFPS | 24 小时内 DNA→蛋白（个性化肿瘤） | 放大中 | | **Northwestern University** | 🇺🇸 美国 | *on-demand* TX-TL 试剂盒 | 纸基/卡盒冻干（Jewett Lab） | 研究 | --- ## 技术栈与创新 该技术栈以 PURE、廉价 ATP 再生和遗传密码扩展为基础。 1. **PURE（重建翻译）:** - 36 种纯化 E. coli 酶 + 70S 核糖体；无蛋白酶/核酸酶→绝对纯度蛋白。 2. **廉价底物 ATP 级联:** - 麦芽糖糊精磷酸化酶 + 淀粉/葡萄糖级联——ATP 再生成本低 100 倍。 3. **遗传密码扩展:** - 无 RF1 裂解物（C321.∆A）——琥珀密码子用于非天然氨基酸（对叠氮苯丙氨酸），实现 ADC 点击化学。 --- ## 价值链与生产管线 ### 无细胞 ADC 合成工业管线 (XpressCF, ISO 9001 / cGMP) ``` ┌───────────────────────────┐ ┌───────────────────────────┐ │ 1. CHO 裂解物 (XpressCF) │ ───> │ 2. 与 DNA + nSAA 反应 │ └───────────────────────────┘ └───────────────────────────┘ │ ▼ ┌───────────────────────────┐ ┌───────────────────────────┐ │ 4. 亲和纯化抗体 │ <─── │ 3. 体外合成，10 小时 │ └───────────────────────────┘ └───────────────────────────┘ │ ▼ ┌───────────────────────────┐ ┌───────────────────────────┐ │ 5. 与毒素点击化学 │ ───> │ 6. 过滤、QC、灌装 │ └───────────────────────────┘ └───────────────────────────┘ ``` #### 阶段 1: CHO 裂解物 在 cGMP 反应器中培养 CHO，去污剂裂解，30,000 g 离心，用微球菌核酸酶去除自身 mRNA。 #### 阶段 2: 反应混合物 反应器加入裂解物、抗体 DNA 模板、能量缓冲液、氨基酸及位于 UAG 密码子的非天然氨基酸（pAMF）。 #### 阶段 3: 无细胞合成 +32°C 下连续补料并透析抑制剂；T7 翻译在 10 小时内产出修饰抗体，滴度 2.5 g/L。 #### 阶段 4: 亲和纯化 Protein A Sepharose 结合抗体；pH 3.0 洗脱，中和至 pH 7.2。 #### 阶段 5: 点击化学 DBO-连接子-毒素（MMAE）在 2 小时内与抗体叠氮基团反应；固定 DAR = 2.0。 #### 阶段 6: 最终控制 0.22 µm 无菌过滤、冻干、MALDI-TOF DAR 控制、无菌和热原检测。